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本试剂盒试剂盒主要采用PCR方法对各种生物材料(如细胞培养物、实验动物分泌物、动物血清等)支原体感染的检测。它综合了几个优势：灵敏、特异、快速并且可以用直接用细胞培养上清液检测。本制品通过PCR方法检测培养细胞等生物材料中的支原体，所用引物为根据支原体16S-23S rRNA序列保守区域设计，只特异性扩增支原体DNA，检出灵敏度与特异性均较高。PCR扩增及电泳分析只需数个小时，操作方便简单。

细胞培养是生命科学研究中常见的实验。不像其它常用的实验方法，细胞培养是一个动态的连续过程，细胞通常会对操作失误或污染物有所反应，这些反应往往表现出不正常的细胞状态或培养基外观。如果受到支原体污染时，细胞形态较之无明显变化，极易被忽视，往往直到污染非常严重时才能发现。受污染的细胞膜上可能有几百个支原体，这些支原体竞争营养并释放有毒的代谢产物，严重影响实验结果。

研究表明，至少二十多种支原体能污染细胞，其中最常见的有：口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、发酵支原体(M.fermentans)、人型支原体(M.hominis)、唾液支原体(M.salivarium)、肺支原体(M.pulmonis)和梨支原体(M.pirum)等。培养细胞的支原体污染率在4%～92%不等，其污染来源包括工作环境、操作者本身(一些支原体是人体的正常菌群)、培养基、血清、细胞交叉污染、实验器材和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。

确认细胞培养过程中出现问题的潜在原因是一项困难且耗时的任务，在细胞培养中，任何突然的变化都应该被怀疑，同时良好的试验规范和定期检测支原体污染也十分必要。支原体检测的方法有很多种，如直接培养、DNA荧光染色、ELISA和PCR法等。

• 使用本试剂前请仔细阅读本说明书全文。
  
• 操作时应尽量少说话，因口腔中也含有支原体，可能引起样品污染，而造成假阳性；整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增应分区域进行，以避免交叉污染。
  
• 实验时，试剂盒组分中的试剂使用前应充分融化并混匀(混匀时禁止激烈振荡，只需要进行上下倒置多次进行混匀)。
  
• 反应管中加好所有的试剂后，应尽快上PCR仪进行扩增，以免形成过多的二聚体。
  
• 细胞培养物中含有青霉素和链霉素等抗生素不会影响本品的检测结果。如果用户需要进一步提高检测灵敏度，建议细胞在不含青霉素和链霉素等抗生素中进行培养2～3天后送样检测。
  
• Positive Control Template长期不用时，可-85~-65℃冷冻保存。
  
• PCR反应极其灵敏，为防止假阳性，加样时，最后加阳性对照。

• 第一轮PCR：
  
  • 充分融解GMyc-1st PCR Mix，按下列表格配制反应液：
    

    成分	实验组	阳性对照	阴性对照
    GMyc-1st PCR Mix	25μL	25μL	25μL
    样品	4μL	4μL	/
    ddH2O	21μL	20μL	25μL
    Positive Control Template	/	1μL	/

    注：为防止Positive Control Template污染，请将实验组和阴性对照组加完以后，最后再将Positive Control Template加入阳性对照组。
    
  • 按下列条件进行PCR反应：
    

    温度	时间	循环数
    94℃	5min	1
    94℃	30s	30～35
    58℃	30s
    72℃	30s
    72℃	7min	1

• 第二轮PCR：
  
  • 充分融解PCR Mix，按下列表格配制反应液：
    

    成分	实验组	阳性对照	阴性对照
    GMyc-2nd PCR Mix	25μL	25μL	25μL
    ddH2O	24μL	24μL	24μL
    1st PCR反应液(1000倍稀释液)	1μL	1μL	1μL

    注：第一轮PCR反应液需经1000倍稀释后方可用于第二轮PCR模板。
    
  • 按下列条件进行PCR反应：
    

    温度	事件	循环数
    94℃	5min	1
    94℃	30s	30～35
    58℃	30s
    72℃	30s
    72℃	7min	1

• 反应结束后，取7μL的PCR反应液(不需要加loading buffer)直接进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物。
  注：跑胶时不需要额外添加loading buffer，但需要额外加入染料，避免出现没有条带的情况。